RetroNectin逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)操作流程

RetroNectin技術(shù)可以顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率，這一發(fā)現(xiàn)克服了向造血干細(xì)胞中導(dǎo)入基因的困難。現(xiàn)在，RetroNectin技術(shù)已成為使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的常規(guī)選擇，其操作流程大致如下：

1. 注射用水或滅菌蒸餾水充分溶解RetroNectin，調(diào)節(jié)濃度至1mg/ml。

2. 0.22 μm濾膜過濾RetroNectin溶液，分裝后-20 ℃保存。

3. 用緩沖液將RetroNectin溶液稀釋至20～100 μg/ml。

4. 將RetroNectin稀釋液加入24孔板，每孔0.5 ml (建議用PBS緩沖液稀釋RetroNectin后包被Non-Tissue Cluture Treated plate。

5. 室溫放置4小時(shí)或4 ℃，避光，過夜。

6. 吸出RetroNectin溶液，每孔加入PBS終止液0.5 ml。

7. 室溫放置30分鐘。

8. 加入適量PBS清洗孔板。

9. 吸出清洗液，得到RetroNectin包被的孔板 (如果暫不使用，可以在孔中加入適量PBS，用膠膜將平板蓋密封，避免RetroNectin干燥，可于4 ℃保存4周。使用前將PBS吸出) 。

10. 逆轉(zhuǎn)錄病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。

11. 將病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。

12. 32 ℃放置4小時(shí)。

13. 吸出病毒保存液。

14. 每孔加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液400 μl (通常細(xì)胞濃度為1 × 105/ml) 。

RetroNectin刺激T細(xì)胞擴(kuò)增方法

T-cell expansion protocol using RetroNectin reagent, GT-T551 T-cell medium, CultiLife bags, and anti-CD3 mAb.

1.  RetroNectin和CD3單克隆抗體包被培養(yǎng)袋。

2.  同時(shí)，來自PBMC的T細(xì)胞用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

3.  第4天，T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋，繼續(xù)用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

4.  第7天，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

5.  第10天，分裝兩個(gè)培養(yǎng)袋，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

RetroNectin® 重組人纖維蛋白片段

RetroNectin^®是在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組人纖維蛋白片段FN CH-296。 當(dāng)包被在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板表面時(shí)，RetroNectin^®能顯著增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。RetroNectin^®重組人纖維蛋白片段和CD3單抗共同作用可刺激T細(xì)胞的增殖和分化。

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