Illumina測(cè)序原理—NGS技術(shù)

原理上，illumina NGS技術(shù)類(lèi)似桑格測(cè)序。DNA合成測(cè)序循環(huán)中，DNA聚合酶催化熒光標(biāo)記的dNTPs到DNA模板鏈上。每次循環(huán)，dNTP被摻入的同時(shí)，核苷被熒光激發(fā)識(shí)別。但zui關(guān)鍵的不同是，不同于合成完后測(cè)序整個(gè)DNA片段，NGS通過(guò)平行測(cè)序模式將過(guò)程高通量化了。

Illumina NGS流程包括四個(gè)步驟：

1. 文庫(kù)制備

DNA或cDNA樣本隨機(jī)片段化后，5′端和 3′端連接接頭。連接好接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化。

圖A 文庫(kù)制備。基因組DNA—片段化—接頭連接—得到測(cè)序文庫(kù)

NGS 文庫(kù)制備：片段化基因組DNA，然后在DNA片段兩端連接特殊接頭。

2. 簇生成

文庫(kù)上樣到流動(dòng)槽，DNA片段通過(guò)接頭和槽內(nèi)寡核苷酸配對(duì)連接。接著，每個(gè)片段通過(guò)橋式法擴(kuò)增成簇克隆。之后，就可以測(cè)序了。

圖B：簇?cái)U(kuò)增

3. 測(cè)序

Illumina SBS 技術(shù)（邊合成邊測(cè)序）在單個(gè)堿基被合成到DNA模板鏈的同時(shí)識(shí)別它。因?yàn)槊總€(gè)測(cè)序循環(huán)都整合4種dNTPs，自然競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制使得偏差zui小化，相比其他測(cè)序技術(shù)原始錯(cuò)誤率低很多。即使用于序列重復(fù)區(qū)域和同聚物，堿基測(cè)序準(zhǔn)確率也是很高的。

圖C 測(cè)序 測(cè)序試劑，包括熒光標(biāo)記的核苷酸，加入后合成。流動(dòng)槽有圖像功能的，每個(gè)簇的熒光激發(fā)都會(huì)被記錄。激發(fā)的波長(zhǎng)和強(qiáng)度可以識(shí)別堿基。這一循環(huán)重復(fù)N次，得到讀長(zhǎng)為N個(gè)堿基的序列。

4. 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和比對(duì)過(guò)程中，測(cè)序序列（reads）與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，能檢測(cè)到多種基因突變，比如單核苷酸多態(tài)性（SNP）或DNA插入缺失（indel），RNA，系統(tǒng)發(fā)育（phylogenetic）或 宏基因組學(xué)分析等。

圖D：序列比對(duì)和數(shù)據(jù)分析 序列（Reads）通過(guò)生物信息學(xué)軟件和參考基因組比對(duì)。比對(duì)后，就能識(shí)別新測(cè)序的序列（reads）和參考基因組的不同。

Illumina*SBS技術(shù)視頻

http://v.youku.com/v_show/id_XMTI1MjA5Mzg5Mg==.html?spm=a2hzp.8253869.0.0

原文 illumina*資料

Illumina NGS workflows include four basic steps:

 1. Library Preparation—The sequencing library is prepared by random fragmentation of the DNA or cDNA sample, followed by5′and 3′adapterligation (Figure 3A). Alternatively,“tagmentation” combines the fragmentation and ligation reactions into a single step that greatly increases the efficiency of the library preparation process.9 Adapter-ligated fragments are then PCR amplified and gelpurified.

2. Cluster Generation—For cluster generation, the library isloaded into a flow cell where fragments are captured on a lawn of surface-bound oligos complementary to the library adapters. Each fragment is then amplified into distinct, clonalclusters through bridge amplification (Figure 3B). When cluster generation is complete, the templates are ready for sequencing.

3 Sequencing—Illumina SBS technology uses a proprietary reversible terminator–based method that detects single bases as they are incorporated into DNA template strands(Figure 3C). As all four reversible terminator–bound dNTPs are present during each sequencing cycle, natural competition minimizes incorporation bias and greatly reduces raw error rates compared to other technologies.6,7 The result is highly accurate base-by-base sequencing that virtually eliminates sequence context–specific errors, even within repetitive sequence regions and homopolymers.

5. Data Analysis—During data analysis and alignment, the newly identified sequence reads are aligned to a reference genome (Figure 3D). Following alignment, many variations of analysis are possible, such as single nucleotide polymorphism (SNP)or insertion-deletion (indel) identification, read counting for RNA methods, phylogenetic or metagenomic analysis, and more.

基因測(cè)序背景知識(shí)-illumina版

DNA測(cè)序簡(jiǎn)介

Illumina下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)使用克隆擴(kuò)增和邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis, SBS）的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)快速、 準(zhǔn)確的測(cè)序。這一過(guò)程在將DNA堿基加入核酸鏈的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。每個(gè)堿基在加入不斷延伸的鏈的同時(shí)發(fā)出*的熒光信號(hào)，這些信號(hào)可以被用來(lái)確定DNA序列的順序。

NGS 技術(shù)可以用來(lái)對(duì)任何一種生物的DNA進(jìn)行測(cè)序，提供有價(jià)值的信息，解答幾乎任何的生物學(xué)問(wèn)題。作為一種高度可擴(kuò)展的技術(shù)，DNA 測(cè)序可以通過(guò)多種方法應(yīng)用于小的、靶向的區(qū)域或整個(gè)基因組，有利于研究人員調(diào)查，并更好地了解健康和疾病。

通過(guò)NGS開(kāi)展DNA測(cè)序的好處

以大規(guī)模并行的方式測(cè)序大段的DNA，與基于毛細(xì)管電泳的Sanger測(cè)序相比，具有通量和規(guī)模上的優(yōu)勢(shì)

提供高分辨率，可在到每個(gè)堿基的水平上查看基因、外顯子組或基因組

根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度可實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定

可檢測(cè)幾乎所有類(lèi)型的基因組改變，包括單核苷酸變異、插入和缺失、拷貝數(shù)變化和染色體畸變

為擴(kuò)展研究和同時(shí)測(cè)序多個(gè)樣品提供高通量和靈活性

主要的DNA測(cè)序方法

全基因組測(cè)序

全基因組測(cè)序是分析基因組的zui全面的方法。迅速降低的測(cè)序成本，以及從完整遺傳密碼中獲得寶貴信息的能力，使得全基因組測(cè)序成為一種強(qiáng)大的研究工具。

靶向重測(cè)序

通過(guò)靶向重測(cè)序，一組基因或基因組區(qū)域被分離出來(lái)并測(cè)序，讓研究人員能夠?qū)r(shí)間、經(jīng)費(fèi)和分析集中在感興趣的特定區(qū)域上。

ChIP測(cè)序

通過(guò)將染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）檢測(cè)和測(cè)序相結(jié)合，ChIP測(cè)序（ChIP-Seq）是鑒定轉(zhuǎn)錄因子及其他蛋白在全基因組范圍內(nèi)的DNA結(jié)合位點(diǎn)的有力方法。

DNA測(cè)序主要應(yīng)用

癌癥DNA測(cè)序

利用NGS進(jìn)行癌癥DNA測(cè)序，可為全基因組研究、靶向的基因圖譜分析、腫瘤-正常樣本的比較等研究提供信息。NGS所提供的靈敏度，足以用于檢測(cè)稀有體細(xì)胞變異、腫瘤亞克隆和循環(huán)DNA片段。

微生物測(cè)序

利用DNA測(cè)序來(lái)分析微生物物種，可為環(huán)境宏基因組學(xué)研究、傳染病監(jiān)測(cè)、分子流行病學(xué)等研究提供信息。

致病變異的發(fā)現(xiàn)

高通量的DNA測(cè)序技術(shù)可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模數(shù)量樣本的快速篩查，從而發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜疾病相關(guān)的致病變異。

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